PCR, ay ang polymerase chain reaction, na tumutukoy sa pagdaragdag ng dNTP, Mg2+, elongation factor at amplification enhancement factor sa system sa ilalim ng catalysis ng DNA polymerase, gamit ang parent DNA bilang template at mga partikular na primer bilang panimulang punto ng extension , Sa pamamagitan ng mga hakbang ng denaturation, annealing, extension, atbp., ang proseso ng in vitro na pagkopya ng daughter strand na DNA na komplementaryo sa parent strand template DNA ay maaaring mabilis at partikular na magpapalaki ng anumang target na DNA sa vitro.
1. Hot Start PCR
Ang oras ng pagsisimula ng amplification sa maginoo na PCR ay hindi upang ilagay ang PCR machine sa PCR machine, at pagkatapos ay magsisimulang lumaki ang programa.Kapag nakumpleto na ang configuration ng system, magsisimula ang amplification, na maaaring magdulot ng hindi partikular na amplification, at malulutas ng hot-start na PCR ang problemang ito.
Ano ang mainit na pagsisimula ng PCR?Matapos maihanda ang sistema ng reaksyon, inilalabas ang enzyme modifier sa mataas na temperatura (karaniwang mas mataas sa 90°C) sa panahon ng paunang yugto ng pag-init ng reaksyon o yugto ng "mainit na pagsisimula", upang ang DNA polymerase ay ma-activate.Ang eksaktong oras ng pag-activate at temperatura ay nakasalalay sa likas na katangian ng DNA polymerase at ang hot-start modifier.Ang pamamaraang ito ay pangunahing gumagamit ng mga modifier gaya ng mga antibodies, affinity ligand, o mga kemikal na modifier upang pigilan ang aktibidad ng DNA polymerase.Dahil ang aktibidad ng DNA polymerase ay pinipigilan sa temperatura ng silid, ang mainit na teknolohiya sa pagsisimula ay nagbibigay ng mahusay na kaginhawahan para sa paghahanda ng maramihang mga sistema ng reaksyon ng PCR sa temperatura ng silid nang hindi sinasakripisyo ang pagtitiyak ng mga reaksyon ng PCR.
2. RT-PCR
Ang RT-PCR (Reverse transcription PCR) ay isang eksperimentong pamamaraan para sa reverse transcription mula sa mRNA patungo sa cDNA at ginagamit ito bilang isang template para sa amplification.Ang eksperimental na pamamaraan ay upang kunin ang kabuuang RNA sa mga tisyu o mga cell muna, gamitin ang Oligo (dT) bilang isang panimulang aklat, gumamit ng reverse transcriptase upang synthesize ang cDNA, at pagkatapos ay gamitin ang cDNA bilang isang template para sa PCR amplification upang makuha ang target na gene o makita ang expression ng gene.
3. Fluorescent quantitative PCR
Fluorescent quantitative PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) ay tumutukoy sa paraan ng pagdaragdag ng mga fluorescent group sa sistema ng reaksyon ng PCR, gamit ang akumulasyon ng mga fluorescent signal upang masubaybayan ang buong proseso ng PCR sa real time, at sa wakas ay ginagamit ang karaniwang curve upang masuri ang dami ng template.Kasama sa mga karaniwang ginagamit na pamamaraan ng qPCR ang SYBR Green I at TaqMan.
4. Nested PCR
Ang nested PCR ay tumutukoy sa paggamit ng dalawang set ng PCR primer para sa dalawang round ng PCR amplification, at ang amplification product ng ikalawang round ay ang target na fragment ng gene.
Kung ang hindi pagtutugma ng unang pares ng mga panimulang aklat (mga panlabas na panimulang aklat) ay nagiging sanhi ng isang hindi partikular na produkto na lumaki, ang posibilidad ng parehong hindi partikular na rehiyon na makilala ng pangalawang pares ng mga panimulang aklat at patuloy na paglaki ay napakaliit, kaya ang amplification ng pangalawang pares ng mga primer, ang pagtitiyak ng PCR ay napabuti.Ang isang bentahe ng pagsasagawa ng dalawang round ng PCR ay nakakatulong ito upang palakasin ang sapat na produkto mula sa limitadong panimulang DNA.
5. Touchdown PCR
Ang Touchdown PCR ay isang paraan upang mapabuti ang pagiging tiyak ng reaksyon ng PCR sa pamamagitan ng pagsasaayos ng mga parameter ng PCR cycle.
Sa touchdown PCR, ang temperatura ng annealing para sa mga unang ilang cycle ay nakatakda ng ilang degrees sa itaas ng maximum na temperatura ng annealing (Tm) ng mga primer.Ang mas mataas na temperatura ng pagsusubo ay maaaring epektibong mabawasan ang hindi tiyak na amplification, ngunit sa parehong oras, ang mas mataas na temperatura ng pagsusubo ay magpapalubha sa paghihiwalay ng mga panimulang aklat at mga target na pagkakasunud-sunod, na magreresulta sa pagbawas ng PCR yield.Samakatuwid, sa unang ilang mga cycle, ang annealing temperature ay karaniwang nakatakdang bumaba ng 1°C bawat cycle upang mapataas ang nilalaman ng target na gene sa system.Kapag ang temperatura ng pagsusubo ay ibinaba sa pinakamainam na temperatura, ang temperatura ng pagsusubo ay pinananatili para sa natitirang mga cycle.
6. Direktang PCR
Ang direktang PCR ay tumutukoy sa amplification ng target na DNA nang direkta mula sa sample nang hindi nangangailangan ng nucleic acid isolation at purification.
Mayroong dalawang uri ng direktang PCR:
direktang paraan: kumuha ng kaunting sample at direktang idagdag ito sa PCR Master Mix para sa PCR identification;
paraan ng pag-crack: pagkatapos ma-sample ang sample, idagdag ito sa lysate, lyse para palabasin ang genome, kumuha ng kaunting lysed supernatant at idagdag ito sa PCR Master Mix, magsagawa ng PCR identification.Pinapasimple ng diskarteng ito ang pang-eksperimentong daloy ng trabaho, binabawasan ang mga hands-on na oras, at iniiwasan ang pagkawala ng DNA sa panahon ng mga hakbang sa paglilinis.
7. SOE PCR
Ang pag-splice ng gene sa pamamagitan ng overlap extension PCR (SOE PCR) ay gumagamit ng mga primer na may komplementaryong dulo upang ang mga produkto ng PCR ay bumubuo ng magkakapatong na mga kadena, upang sa kasunod na reaksyon ng amplification, sa pamamagitan ng pagpapalawig ng mga magkakapatong na chain, iba't ibang mga mapagkukunan ng Isang pamamaraan kung saan ang mga amplified na fragment ay magkakapatong. at pinagdugtong-dugtong.Ang teknolohiyang ito ay kasalukuyang may dalawang pangunahing direksyon ng aplikasyon: pagbuo ng mga fusion genes;gene site-directed mutation.
8. IPCR
Gumagamit ang Inverse PCR (IPCR) ng mga reverse complementary primer para palakihin ang mga fragment ng DNA maliban sa dalawang primer, at pinapalaki ang mga hindi kilalang sequence sa magkabilang panig ng isang kilalang fragment ng DNA.
Ang IPCR ay orihinal na idinisenyo upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng mga katabing hindi kilalang rehiyon, at kadalasang ginagamit upang pag-aralan ang mga pagkakasunud-sunod ng tagataguyod ng gene;oncogenic chromosomal rearrangements, tulad ng gene fusion, translocation at transposition;at viral gene integration, ay karaniwang ginagamit na ngayon Para sa site-directed mutagenesis, kopyahin ang isang plasmid na may gustong mutation.
9. dPCR
Ang Digital PCR (dPCR) ay isang pamamaraan para sa ganap na dami ng mga molekula ng nucleic acid.
Sa kasalukuyan ay may tatlong mga pamamaraan para sa dami ng mga molekula ng nucleic acid.Ang photometry ay batay sa pagsipsip ng mga molekula ng nucleic acid;Ang real-time na fluorescent quantitative PCR (Real Time PCR) ay batay sa Ct value, at ang Ct value ay tumutukoy sa cycle number na tumutugma sa fluorescence value na maaaring makita;Ang digital PCR ay ang pinakabagong Quantitative na teknolohiya batay sa single-molecule PCR method para sa pagbibilang ng nucleic acid quantification ay isang absolute quantitative method.
Oras ng post: Hun-13-2023