Paggamit at pag-iingat ng ultrafiltration centrifuge tube
1) Pumili ng angkop na ultrafiltration tube.Tandaan na ang mga lamad ng UF ay naiiba sa kanilang antas ng pagpapaubaya sa iba't ibang mga kemikal.Karaniwan, ang mga ultrafiltration tube na may 10 kDa molecular weight cut-off ay maaaring piliin na may molecular weight cut-off na hindi dapat mas malaki sa 1/3 ng molecular weight ng protina na kinaiinteresan, gaya ng 35 kDa.Kung ang molekular na bigat ng protina na interesado ay nasa paligid ng 10 kd, maaaring gumamit ng ultrafiltration tube na may cut-off ng molekular na timbang na 3 KD.
(2) Ang ultrafiltration, bagong binili, ay tuyo, na may ultrapure na tubig na idinagdag bago gamitin at ang tubig ay ganap na dumaan sa lamad, ice bath o refrigerator na paunang pinalamig sa loob ng ilang minuto.Pagkatapos ay ibubuhos ang tubig, ibig sabihin, ang likidong protina, at kung magkano ang idinagdag, alinman ang hindi hihigit sa puting linya sa tuktok ng tubo.Ang operasyon ay magaan, at ang ultrafiltration tube ay kailangang palamigin sa yelo bago idagdag ang solusyon sa protina.
3) Parehong ang masa at sentro ng grabidad ay upang maabot ang balanse.Tandaan na ang bilis ng pag-ikot at acceleration ay hindi masyadong mabilis, kung hindi man ay direktang nakakapinsala sa ultrafiltration membrane.Sinimulan ang centrifugal ultrafiltration (centrifuge precooled sa 4 degrees).Matapos ang RPM ng iba't ibang mga centrifuges ay na-convert sa g, ito ay naiiba.Ang acceleration ng centrifuge ay nababagay sa pinakamaliit, na binabawasan ang presyon sa lamad.Tandaan, siguraduhing umalis sa centrifuge pagkatapos maabot ng centrifuge ang bilis ng patutunguhan nito, o kung mayroon kang problema, hindi mo ito mahawakan sa unang pagkakataon.Ang oryentasyon ng lamad sa spindle ay nababagay ayon sa mga tagubilin (angular centrifuge case ay lamad sa axis na patayo).Sa praktikal na paggamit, ang pangkalahatang bilis ng pag-ikot ay mas mababa kaysa sa mga tagubilin, upang ang buhay ng centrifuge tube ay maaaring pahabain.
3) Parehong ang masa at sentro ng grabidad ay upang maabot ang balanse.Tandaan na ang bilis ng pag-ikot at acceleration ay hindi masyadong mabilis, kung hindi man ay direktang nakakapinsala sa ultrafiltration membrane.Sinimulan ang centrifugal ultrafiltration (centrifuge precooled sa 4 degrees).Matapos ang RPM ng iba't ibang mga centrifuges ay na-convert sa g, ito ay naiiba.Ang acceleration ng centrifuge ay nababagay sa pinakamaliit, na binabawasan ang presyon sa lamad.Tandaan, siguraduhing umalis sa centrifuge pagkatapos maabot ng centrifuge ang bilis ng patutunguhan nito, o kung may problema ka, hindi mo ito mahawakan sa unang pagkakataon.Ang oryentasyon ng lamad sa spindle ay nababagay ayon sa mga tagubilin (angular centrifuge case ay lamad sa axis na patayo).Sa praktikal na paggamit, ang pangkalahatang bilis ng pag-ikot ay mas mababa kaysa sa mga tagubilin, upang ang buhay ng centrifuge tube ay maaaring pahabain.
(4) Kapag naka-concentrate sa natitirang 1ml, kumuha ng 50ul ng buffer solution, magdagdag ng 10ul of flow through at tingnan kung mayroong anumang kulay asul, bilang isang paghuhusga kung ang ultrafiltration tube ay nawawalang protina.Kung ang tubo ay tumutulo, muling ibuhos ang itaas na layer at dumaloy sa isang bagong tubo upang simulan ang ultrafiltration.Upang tiyak na matukoy kung ang mga tubo ay napalampas, centrifuge para sa 10min na may 5mgml ng BSA bago ang flowthrough, tumatakbo sa protina glue, o Bradford crude assay, at magpatuloy sa pamamagitan ng pagdaragdag ng natitirang concentrated protein solution (na gumagana sa yelo at pinipigilan ang mga protina mula sa pag-init) hanggang lahat ng concentrate ay naidagdag na.Mag-ingat sa panahon ng centrifugation kung ang pag-ulan ng mga protina ay nangyayari, na humahantong sa pagsasara ng tubo.Kung nangyari ang pag-ulan, alamin kung ang tiyak na sanhi ng pag-ulan ay isang labis na konsentrasyon ng protina o isang hindi naaangkop na buffer;Ang una ay maaaring malutas sa pamamagitan ng ultrafiltration ng maraming ultrafiltration tubes nang sabay-sabay, pagpapababa ng konsentrasyon, at ang huli sa pamamagitan ng pagpapalitan ng iba't ibang mga solusyon sa buffer hanggang sa walang precipitation ng protina na nangyayari.
(4) Kapag naka-concentrate sa natitirang 1ml, kumuha ng 50ul ng buffer solution, magdagdag ng 10ul of flow through at tingnan kung mayroong anumang kulay asul, bilang isang paghuhusga kung ang ultrafiltration tube ay nawawalang protina.Kung ang tubo ay tumutulo, muling ibuhos ang itaas na layer at dumaloy sa isang bagong tubo upang simulan ang ultrafiltration.Upang tiyak na matukoy kung ang mga tubo ay napalampas, centrifuge para sa 10min na may 5mgml ng BSA bago ang flowthrough, tumatakbo sa protina glue, o Bradford crude assay, at magpatuloy sa pamamagitan ng pagdaragdag ng natitirang concentrated protein solution (na gumagana sa yelo at pinipigilan ang mga protina mula sa pag-init) hanggang lahat ng concentrate ay naidagdag na.Mag-ingat sa panahon ng centrifugation kung ang pag-ulan ng mga protina ay nangyayari, na humahantong sa pagsasara ng tubo.Kung nangyari ang pag-ulan, alamin kung ang tiyak na sanhi ng pag-ulan ay isang labis na konsentrasyon ng protina o isang hindi naaangkop na buffer;Ang una ay maaaring malutas sa pamamagitan ng ultrafiltration ng maraming ultrafiltration tubes nang sabay-sabay, pagpapababa ng konsentrasyon, at ang huli sa pamamagitan ng pagpapalitan ng iba't ibang mga solusyon sa buffer hanggang sa walang pag-ulan ng protina na nangyayari.
(5) Ang mga unang hakbang ay ginagamit upang pagsamahin ang protina, at kung ang buffer ay papalitan, dahan-dahang magdagdag ng bagong buffer (ultrafiltration sa pamamagitan ng 0.22um ultrafiltration membrane) sa humigit-kumulang 1ml ng kabuuang protina, at muling tumutok sa humigit-kumulang 1ml para sa tatlo magkakasunod na beses, na may panghuling puro huling dami depende sa nais na konsentrasyon ng protina, sa pangkalahatan ay hindi hihigit sa 500ul, ngunit din sa loob ng 200ul.Makamit ang 1000 × o higit pa sa tatlong pagkakataon, sa pangkalahatan ay kasing dami ng pagbabago sa buffer, na kinakalkula ng hindi bababa sa 10 × o higit pang pagpapayaman ng volume sa bawat pagkakataon.
(5) Ang mga unang hakbang ay ginagamit upang pagsamahin ang protina, at kung ang buffer ay papalitan, dahan-dahang magdagdag ng bagong buffer (ultrafiltration sa pamamagitan ng 0.22um ultrafiltration membrane) sa humigit-kumulang 1ml ng kabuuang protina, at muling tumutok sa humigit-kumulang 1ml para sa tatlo magkakasunod na beses, na may panghuling puro huling dami depende sa nais na konsentrasyon ng protina, sa pangkalahatan ay hindi hihigit sa 500ul, ngunit din sa loob ng 200ul.Makamit ang 1000 × o higit pa sa tatlong pagkakataon, sa pangkalahatan ay kasing dami ng pagbabago sa buffer, na kinakalkula ng hindi bababa sa 10 × o higit pang pagpapayaman ng volume sa bawat pagkakataon.
Oras ng post: Nob-09-2022